^{临床研究院/疑难疾病精准研究中心-李胜利团队与合作者解析视网膜母细胞瘤局部侵袭的单细胞转录组特征}

^{视网膜母细胞瘤(RB)是最常见的儿童恶性肿瘤，其预后在过去50年中有所改善。RB已成为高收入国家可治愈的疾病，10年总生存率大于95%，人们的注意力已经转移到挽救眼睛和改善生活质量上。然而目前RB的治疗效果仍不理想。即使在高收入国家，也有30%的患者(多数处于眼内晚期)接受了眼球摘除术。此外，在低收入和中等收入国家(占全球RB病例的80%以上)，由于诊断和治疗延迟，预后较差。低收入国家49.1%的患者有眼外RB, 18.9%的病例有转移性进展。局部晚期RB不仅会导致生命危险，也使挽救眼球的可能性更小，选择摘除还是保留眼球成为困扰患者家属和医生的一大难题。一般来说，转移过程的步骤包括起始阶段的局部扩展和转移，随后向远处部位迁移并定植。一旦RB突破眼膜并发生局部延伸和侵袭，RB患者的预后就会急剧恶化。然而，RB眼外扩展的机制尚未阐明。解析RB局部转移过程中的分子特征将为患者的治疗提供更好的策略。}

^{2024年1月3日，上海交通大学医学院附属第一人民医院疑难疾病精准研究中心李胜利教授团队和中山大学眼科中心卢蓉教授团队联合在Communications Biology杂志上发表了题为“Single-cell transcriptomics enable the characterization of local extension in retinoblastoma”的研究论文。研究团队对4个RB样本(2个来自眼内和2个来自眼外RB患者)进行了单细胞RNA测序，并整合了5个正常视网膜样本、4个眼内样本和3个眼外RB样本的公开数据集，在单细胞水平上表征了RB局部延伸的过程。在9种主要细胞类型中，总共获得了128454个质量合格的细胞。拷贝数变异分析揭示了眼外RB样本细胞中染色体6p扩增。在细胞异质性分析中，分别在视锥前体样细胞、视网膜瘤样细胞和MKI67+光感受器降低细胞(MKI67+ PhrD)中鉴定出10、8和7个细胞亚群。在眼外样本的细胞特别是在MKI67+ PhrD细胞中检测到SOX4高表达，这在其他临床RB样本中得到了证实。这些结果表明SOX4可能驱动RB局部侵袭。}

^{研究团队使用Seurat R软件包对scRNA-seq数据进行质量控制、批效应校正、归一化、整合和聚类，数据整合消除了不同样本之间的批次效应。在去除低质量细胞和双重细胞后，共获得128454个质量合格的细胞。在眼外和眼内RB样本中分别检测到55492和61882个细胞。部分细胞仅在眼外RB样本中检测到，表明这部分细胞可能具有高水平的局部侵袭能力。细胞周期分析显示，不同时期的细胞Cluster是分开的。在聚类之前，研究团队对细胞周期的影响进行了回归分析。根据高度可变基因的表达模式，将所有细胞分成24个Cluster。根据细胞类型标记的表达特征，在这些细胞群中鉴定出9种不同的细胞类型，包括锥体前体细胞样细胞(CPL细胞，n = 72554)、MKI67+光感受器降低细胞(MKI67+ PhrD，n = 30569)、杆前体细胞样细胞(n = 11878)、视网膜瘤样细胞(RL细胞，n = 5733)、杆或杆样细胞(n = 3206)、双极细胞(n = 1678)、müller胶质细胞(n = 1165)、小胶质细胞(n = 1103)、锥细胞或锥状细胞(n = 568)。这些细胞类型特异性表达相应的细胞类型标记基因，表明具有独特的生物学功能。例如，MKI67+ PhrD细胞高水平表达MKI67、TOP2A、UBE2C、BIRC5和TPX2基因。在本数据集中，视锥细胞或视锥样细胞、杆状细胞或杆状细胞和视网膜瘤样细胞主要存在于眼内RB样本中，而小胶质细胞和杆状前体细胞样细胞主要存在于眼外RB样本中。此外，在RB肿瘤细胞中检测到染色体臂1q、2p和6p的增加和染色体臂3q和16q的减少。有趣的是，眼外RB样本中6p染色体CNV增加的细胞比例(52.8%)高于眼内RB样本。研究团队发现80%(4/5)的眼外RB样本，而眼内RB样本均无显著的6p染色体扩增。眼外RB样本的总体CNV水平高于眼内RB样本。总的来说，研究团队的分析通过单细胞转录谱呈现了眼内和眼外RB样本之间的细胞和分子差异。}

^{视锥前体细胞样细胞、视网膜瘤样细胞和MKI67+ PhrD细胞构成眼内和眼外RB样本的主要细胞成分。这三种细胞类型的细胞比例在眼内和眼外RB样本中没有显着差异。大多数CPL细胞在眼内和眼外RB样本中表现出相似的总体表达模式。然而，个体基因表现出差异表达水平，其中66个基因上调（如TUBB2B和TMEM14C），25个基因下调（如GAS5和PDC）。关于RL细胞，眼内和眼外RB样本之间检测到相似的部分。在眼外RB样本中，RL细胞中有27个基因上调，40个基因下调。MKI67+ PhrD细胞亚群在眼外和眼内RB样本中也分布均衡。在MKI67+ PhrD细胞中，55个基因在眼外RB样品中表达上调，21个基因在眼外RB样品中表达下调。此外，研究团队进行了功能富集分析，以探索眼内和眼外RB在生物学功能上的潜在差异。CPL和MKI67+ PhrD细胞中的差异基因在“蛋白稳定性”、“对未折叠蛋白的反应”、“对拓扑不正确蛋白的反应”等蛋白稳定性相关功能上富集。此外，RL细胞在“典型糖酵解”和“NADH再生”等代谢相关功能上也存在差异。总之，研究团队在CPL、RL和MKI67+ PhrD细胞中表征了眼内和眼外RB细胞类型特异性转录差异。}

^{为了进一步探索CPL、RL和MKI67+ PhrD细胞的细胞异质性，研究团队鉴定了每种细胞类型的亚群。CPL中检测到10个细胞亚群。这10个CPL亚群具有不同的基因标记特征。最大的CPL亚群(CPL-1, n = 21099)特异性表达TFF1和TUBA1B。CPL-1亚群表现出与能量代谢相关的过程，如“线粒体呼吸链复合物组装”。CPL-7和CPL-10细胞亚群主要存在于眼内RB样本中，而CPL-5和CPL-9细胞亚群大部分存在于眼外RB样本中。在5733个RL细胞中，研究团队鉴定了8个RL细胞亚群。与其他亚群相比，RL-4、RL-5、RL-7和RL-8细胞表现出高度不同的转录组特征。RL-5亚群高表达基因BAG3和HSPH1，而RL-7只表达基因C11or87。RL-3、RL-7和RL-8亚群高表达内质网相关基因。大部分RL亚群存在于眼内RB样本中。基于基因表达谱的聚类，将MKI67+ PhrD细胞分为7个不同的亚群。在MKI67+ PhrD细胞中，PhrD-1和PhrD-2亚群占很大比例(62.6%)。PhrD-1亚群的特征是高表达基因CENPX和GNB3，而PhrD-3亚群的特征是高表达基因ASPM和UBE2C。PhrD-2亚群在细胞增殖相关功能，如“细胞周期G1/S阶段转变”和“核分裂”方面表现出高活性。PhrD-6细胞亚群主要在眼内RB样本中检测到。总之，研究团队的细胞亚群分析揭示了RB样本的CPL、RL和MKI67+ PhrD细胞的细胞和分子异质性。}

^{接下来，研究团队通过拟时序轨迹分析来推断主要细胞类型及其亚群在局部侵袭发展过程中的进化过程。结果表明，CPL、RL和MKI67+ PhrD细胞均显示出清晰的拟时序路径。这些细胞的一些亚群展现了局部侵袭特征，也显示出较高的G2M评分。在CPL、RL和MKI67+ PhrD细胞中鉴定出四个不同表达模式的Cluster。CPL细胞Cluster 1中的基因，如NES、RB1和RHO，在拟时序轨迹的末端显示出特异性的高表达。Cluster 1基因可能赋予部分CPL细胞的局部侵袭特征。在RL细胞中，Cluster1、3和4在开始时表现出高转录活性，而Cluster2仅在拟时序轨迹的末尾才表现出高表达。Cluster 4 MKI67+ PhrD细胞沿拟时序轨迹表达水平下降。MKI67+ PhrD细胞Cluster 2中MYCN和POU5F1等基因沿拟时序轨迹表达增加，提示其参与RB的局部侵袭。进一步分析CPL、RL和MKI67+ PhrD细胞亚群的拟时序轨迹。CPL-5亚群中的细胞分布在CPL轨迹路径的末端。在拟时序轨迹路径结束时，仅检测到一小部分RL细胞(即RL-7和RL-8亚群)。对于MKI67+ PhrD细胞，在轨迹路径的起点检测到PhrD-2亚群，而PhrD-5和PhrD-6细胞分布在拟时序路径的中间。MKI67+ PhrD-4和PhrD-7亚群的主要部分在轨迹结束时被检测到。这些MKI67+ PhrD细胞亚群可能在RB侵袭到眼外部位的进展结束时发生。}

^{为了确定可能参与RB局部侵袭调控的转录因子，研究团队采用了单细胞调控网络推断和聚类(SCENIC)方法。研究团队的分析分别发现了1个和3个特异性转录因子在眼内和眼外RB样本中显示出显著的调节作用。其中，SOX4在眼外RB样品中的AUC值明显较高。与眼内RB样本相比，眼外RB样本细胞中SOX4表达高。此外，在眼外RB样本的更多MKI67+ PhrD细胞中检测到SOX4的调控活性。此外，研究团队对7例诊断为眼内RB和7例诊断为眼外RB的临床样本进行了SOX4的免疫荧光检测，发现SOX4在眼外RB样本中高度表达。qPCR和western blot分析进一步显示，与眼内RB样本相比SOX4在眼外RB样本中高表达。此外，相关分析显示在CPL细胞、RL细胞和MKI67+ PhrD细胞中，SOX4基因表达水平分别与推断的CNV水平呈显著正相关。}

^{为了进一步探讨SOX4表达与RB发生发展的临床病理特征之间的关系，研究团队对47例RB肿瘤样本进行了SOX4免疫染色(男性22例，占46.8%；女性25例，占53.2%)。根据阳性评分和强度评分的乘积计算免疫反应性评分，研究团队将样本分为两组:高SOX4表达(免疫反应性评分≥4)和低SOX4表达(免疫反应性评分<4) RB肿瘤。免疫反应性分析显示SOX4主要定位于细胞核，有20例SOX4高表达(42.6%)，27例SOX4低表达(57.4%)RB肿瘤。SOX4表达水平与视神经侵袭之间存在显著相关性(P = 0.0089)，而与其他临床病理特征没有明显联系。这些结果表明，SOX4可能在RB局部侵袭中发挥调节作用，为预防RB局部侵袭提供了潜在的治疗靶点。}

^{总之，该研究表征了眼内和眼外RB样本的单细胞转录图谱，揭示了原发性RB和局部侵袭RB在细胞和分子异质性上的特征。研究团队的分析还确定了可能参与RB局部侵袭进展的候选细胞亚群和转录因子。这些发现为RB的疾病进展提供了单细胞层面的证据，并为RB患者的诊断和治疗提供了潜在的靶点。}

^{原文链接：https://www.nature.com/articles/s42003-023-05732-y}